Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 6

Rodzicielski DNA, stosowany w celu wykluczenia delecji u pacjentów homozygotycznych, był dostępny tylko z jednej rodziny. Ekspresja tkanki i charakterystyka białka
Przeszukaliśmy bazy danych znanych ekspresji sekwencji ludzkiego genomu, aby ustalić ekspresję tkanki genu C2orf25. Wydaje się, że gen ten ulega ekspresji na wysokich poziomach w większości tkanek (uwaga 2 w dodatkowym dodatku). W celu wykrycia możliwych wielokrotnych transkryptów, amplifikowano C2orf25 z fibroblastowego matrycowego RNA (mRNA), stosując RT-PCR i różne startery. Znaleźliśmy tylko jeden produkt cDNA, z regionem kodującym 891 bp, kodujący przypuszczalny polipeptyd o 296 aminokwasach i przewidywaną masę cząsteczkową 32,8 kD (Figura 3). Reszty do 12 stanowią możliwą sekwencję liderową mitochondrialną, która sugeruje celowanie ekspresjonowanego białka do mitochondriów.16 Reszty 81, chociaż 86, pasują do motywu wiążącego witaminę B12, Asp-Xaa-His-Xaa-Xaa-Gly, stanowiąc przypuszczalne miejsce wiązania dla kobalaminy
Ekspresja ludzkiego cDNA C2orf25 w fibroblastach
Figura 4. Figura 4. Ekspresja alleli typu dzikiego i zmutowanych ludzkich MMADHC (kwas metylomalonowy, typ cblD i homocystynuria) w unieśmiertelnionej połączonej z cblD, cblD-homocystynurii i kontrolnych fibroblastach. Komórki od Pacjenta 7 z fenotypem złożonym z cblD (homozygotyczny pod względem 696 + 1_4delGTGA), Pacjentem 2 z fenotypem cblD-homocystynurii (cblD-HC) (związek heterozygotyczny pod względem mutacji missense 545C . A i 746A . G) i jedną kontrolą unieśmiertelniony i używany do eksperymentów transfekcji. Przejściową transfekcję przeprowadzono za pomocą elektroporacji z wektorami pTracer (pTr) zawierającymi allel MMADHC: allel typu dzikiego, jeden z trzech alleli missense (545C . A, 746A . G, lub 776T . C) związanych z cblD-HC lub delecję przesunięcia ramki 57_64delCTCTTTAG lub mutację nonsensowną 160C . T związaną z kwasem mocznikowym CblD-metylomalonowym. Aktywność tła mierzono w komórkach transfekowanych pustym wektorem pTracer (tylko pTr). Panel A pokazuje tworzenie metioniny z mrówczanu [14C], a panele B i C pokazują syntezę odpowiednio metylokobalaminy i adenozylokobalaminy z [57C] cyjanokobalaminy. Transfekcję połączonej z cblD linii komórkowej i kontrolnej linii komórkowej przeprowadzono także z wektorem pcDNA3.2 / V5 zawierającym MMADHC typu dzikiego. Aktywność tła mierzono w komórkach transfekowanych pustym wektorem pcDNA3 (tylko pcDNA3.2). Dane są średnie, a słupki I wskazują zakres wyników pojedynczych oznaczeń z każdego eksperymentu. W przypadku paneli A i B wartości pochodzą z trzech powtórzeń eksperymentów, a wartości P są pokazane tylko dla porównań wskazujących na uratowanie funkcji. W przypadku panelu C wartości wektora pTracer pochodzą z siedmiu powtórzonych eksperymentów, a wartości wektora pcDNA3.2 pochodzą z trzech powtórzeń eksperymentów.
Aby udowodnić, że gen C2orf25 jest odpowiedzialny za fenotyp cblD, przetestowaliśmy zdolność konstruktów typu dzikiego i zmutowanych do ratowania funkcji komórek (ryc. 4). Konstrukt typu dzikiego uratował syntezę metioniny i syntezę metylokobalaminy, które zostały przywrócone do 52 do 100% wartości kontrolnych w obu cblD-homocystynuriach i połączonych fibroblastach cblD przy użyciu wektora pTracer (Figura 4A i 4B).
[podobne: afronis opinie, letrox cena, cynarex opinie ]

Powiązane tematy z artykułem: afronis opinie cynarex opinie letrox cena