Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD cd

Linia komórkowa fibroblastów od jednego z siedmiu pacjentów została wcześniej przypisana do nowej grupy dopełniacza (cblH) przez Watkins i wsp., 6, ale pokazujemy tutaj, że w rzeczywistości należy ona do grupy dopełniacza cblD (ryc. w Dodatku Dodatek, dostępny wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Transfer chromosomu za pośrednictwem mikrokomórki
Mysie-ludzkie monochromosomalne hybrydowe linie komórkowe (komórki dawcy), z których każda niosła pojedynczy ludzki chromosom znakowany genem oporności na higromycynę, 7 użyto do seryjnej transfekcji jednej z unieśmiertelnionych linii komórkowych cblD-homocystynuria (komórki biorcy) przy użyciu mikrokomórki pośredniczy transfer chromosomów, jak opisano wcześniej8 (patrz także Tabela w Dodatku Uzupełniającym). Komórki zawierające każdy transfekowany ludzki chromosom wybrano na podstawie wzrostu w pożywce zawierającej higromycynę. Kolonie hodowano i testowano pod kątem syntezy metylkobalaminy. Te, które wykazywały taką syntezę, a tym samym ratowanie funkcji komórkowej, zostały zdefiniowane jako kolonie dodatnie; te, które nie zostały zdefiniowane jako negatywne kolonie.
Gene Mapping
Pozytywne kolonie testowano pod kątem zanieczyszczenia DNA mysim za pomocą specyficznych dla myszy markerów mikrosatelitarnych BAM5 i RSINE1 SINE / B4.9,10 Pozytywne kolonie, które były wolne od zanieczyszczenia DNA myszy i negatywnych kolonii, były następnie stosowane do dokładnego mapowania chromosom dawcy, za pomocą markerów mikrosatelitarnych, w celu zdefiniowania segmentu chromosomalnego zawierającego przypuszczalny gen odpowiadający defektowi cblD. Obecność tych markerów mikrosatelitarnych została przetestowana przy użyciu testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), obejmującego fluorescencyjnie znakowane startery. Produkty wizualizowano w zautomatyzowanym sekwenserze (ABI Prism 3100, Applied Biosystems) i analizowano za pomocą oprogramowania Genotyper (wersja 2.5, Applied Biosystems). Region chromosomalny zdefiniowany przez markery mikrosatelitarne zbadano pod kątem genów kandydujących, a odpowiedni kandydat wyselekcjonowano na podstawie charakterystyki sekwencji.
Sekwencjonowanie DNA i analiza mutacji
Całkowity RNA wyekstrahowano z hodowanych fibroblastów przy użyciu zestawu RNeasy Kit (Qiagen), a pełnej długości komplementarny DNA (cDNA) dla genu będącego kandydatem amplifikowano za pomocą testu PCR z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) z udziałem specyficznych primerów. i był sekwencjonowany zgodnie z metodą ABI BigDye (Applied Biosystems). W celu potwierdzenia mutacji zidentyfikowanych w produktach RT-PCR, odpowiednie egzony amplifikowano poprzez test PCR z genomowego DNA, z zastosowaniem flankujących intronów intronowych, i sekwencjonowano.
Ekspresja cDNA kandydata genu w fibroblastach
Konstrukty zawierające sekwencje cDNA typu dzikiego i zmutowanego dla genu będącego kandydatem przygotowano w wektorach ekspresyjnych pTracer-CMV2 lub pcDNA3.2 / V5 (Invitrogen), jak opisano poprzednio.11 Konstrukty transfekowano do unieśmiertelnionych fibroblastów za pomocą elektroporacji. Skuteczność transfekcji wynosiła 5 do 22%, co określono przez oszacowanie proporcji komórek koeksprymujących białko zielonej fluorescencji z konstruktu pTracer. Ratowanie funkcji komórkowej testowano przez pomiar syntezy metioniny i metylokobalaminy lub syntezy adenozylokobalaminy.
Analiza statystyczna
Zbadaliśmy istotność statystyczną danych dotyczących ratowania funkcji za pomocą niesparowanego t-testu (dwustronnego), z poprawką Welcha dla nierównych wariancji i oprogramowania GraphPad Prism (wersja 4)
[przypisy: konspekt treningu piłki nożnej seniorów, wyszukiwarka kodów icd 10, syrop clemastinum ]

Powiązane tematy z artykułem: konspekt treningu piłki nożnej seniorów syrop clemastinum wyszukiwarka kodów icd 10