Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 8

To tłumaczy wyizolowaną kwasowość metylomalonową bez homocystynurii u Pacjentów 3 i 4 i jest zgodne z ratowaniem syntezy metioniny i metylokobalaminy w cblD-homocystynurii i połączonych komórkach CblD transfekowanych zmutowanymi allelami 57_64del i 160C . T. Na poparcie tej hipotezy o ponownym wprowadzaniu translacji , silna sekwencja konsensusowa Kozaka19 występuje w pozycjach cDNA 184-3 i 184 + 4 (A w pozycji -3 i G w pozycji +4) w genie MMADHC. Obydwaj pacjenci z wyizolowanym homocystynurią mają mutacje missense (545C . A, 746A . Continue reading „Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 8”

Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 7

Synteza adenozylocobalaminy nie była powtarzalnie korygowana za pomocą konstruktu dzikiego typu pTracer. Aby przetestować na ratunek syntezy adenozylokobalaminy, powtórzyliśmy eksperyment z wektorem DNA3.2 / V5 zawierającym konstrukt typu dzikiego i wykazaliśmy przywrócenie syntezy adenozylokobalaminy do 68% wartości kontrolnej w połączonej linii komórkowej cblD (Figura 4C) . Konstrukty zawierające allele sensuzy związane z izolowaną homocystynurią (545C . A, 746A . G i 776T . Continue reading „Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 7”

Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 6

Rodzicielski DNA, stosowany w celu wykluczenia delecji u pacjentów homozygotycznych, był dostępny tylko z jednej rodziny. Ekspresja tkanki i charakterystyka białka
Przeszukaliśmy bazy danych znanych ekspresji sekwencji ludzkiego genomu, aby ustalić ekspresję tkanki genu C2orf25. Wydaje się, że gen ten ulega ekspresji na wysokich poziomach w większości tkanek (uwaga 2 w dodatkowym dodatku). W celu wykrycia możliwych wielokrotnych transkryptów, amplifikowano C2orf25 z fibroblastowego matrycowego RNA (mRNA), stosując RT-PCR i różne startery. Znaleźliśmy tylko jeden produkt cDNA, z regionem kodującym 891 bp, kodujący przypuszczalny polipeptyd o 296 aminokwasach i przewidywaną masę cząsteczkową 32,8 kD (Figura 3). Continue reading „Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 6”

Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 5

To zmapowało gen cblD do regionu chromosomu 2q22.1-2q23.3 (figura 2A), który zawiera 28 genów (zgodnie z mapą genetyczną deCODE, szczegóły patrz numery dostępu i adresy URL w uwadze w dodatkowym dodatku) . Gen C2orf25 został wybrany jako kandydat z uwagi na jego homologię14 do domniemanego mitochondrialnego składnika ATPazy z transportera kasety wiążącej ATP (YP_218380) i dlatego transport kobalaminy w bakteriach jest ułatwiony przez system transportu ABC.15 Analiza mutacji
Pełnej długości cDNA dla genu kandydata C2orf25 amplifikowano za pomocą RT-PCR i specyficznych starterów (Tabela 3 w Dodatkowym dodatku). Gen C2orf25 następnie zsekwencjonowano z cDNA od każdego z siedmiu pacjentów z defektem cblD i zidentyfikowano mutacje dla każdego pacjenta. Mutacje te zostały następnie potwierdzone za pomocą amplifikacji PCR odpowiednich eksonów z genomowego DNA, z udziałem flankujących intronów intronowych (Tabela 3 w Dodatku Uzupełniającym). Zidentyfikowaliśmy dziewięć mutacji, z dwoma zmutowanymi allelami u każdego pacjenta (Tabela i Figura 2B). Continue reading „Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad 5”

Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD cd

Linia komórkowa fibroblastów od jednego z siedmiu pacjentów została wcześniej przypisana do nowej grupy dopełniacza (cblH) przez Watkins i wsp., 6, ale pokazujemy tutaj, że w rzeczywistości należy ona do grupy dopełniacza cblD (ryc. w Dodatku Dodatek, dostępny wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Transfer chromosomu za pośrednictwem mikrokomórki
Mysie-ludzkie monochromosomalne hybrydowe linie komórkowe (komórki dawcy), z których każda niosła pojedynczy ludzki chromosom znakowany genem oporności na higromycynę, 7 użyto do seryjnej transfekcji jednej z unieśmiertelnionych linii komórkowych cblD-homocystynuria (komórki biorcy) przy użyciu mikrokomórki pośredniczy transfer chromosomów, jak opisano wcześniej8 (patrz także Tabela w Dodatku Uzupełniającym). Komórki zawierające każdy transfekowany ludzki chromosom wybrano na podstawie wzrostu w pożywce zawierającej higromycynę. Kolonie hodowano i testowano pod kątem syntezy metylkobalaminy. Continue reading „Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD cd”

Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad

Wewnątrz komórki przekształca się w dwa aktywne kofaktory: adenozylokobalaminę i metylokobalaminę (ryc. 1) .1 Adenozylokobalamina jest koenzymem dla mitochondrialnej mutacji metylomalonylo-koenzymu A, która przekształca L-metylomalonylo-koenzym A w sukcynylo-koenzym A i bierze udział w katabolizm kwasów tłuszczowych o łańcuchach nieparzystych i niektórych aminokwasów. Metylokobalamina jest koenzymem cytosolowej syntazy metioninowej, która przekształca homocysteinę w metioninę i jest niezbędna do normalnego metabolizmu jednego węgla, który z kolei bierze udział w ważnych procesach komórkowych, takich jak metylacja i synteza DNA.1. Zakłócenia syntezy kobalamin-kofaktorów spowodowane nabyciem lub zmiany dziedziczne powodują podwyższenie poziomu homocysteiny i kwasu metylomalonowego, które są związane z wielonarządowymi nieprawidłowościami klinicznymi podobnymi do obserwowanych u pacjentów z ciężkim niedoborem witaminy B12, w tym letarg, hipotonia, opóźnienie rozwoju, napady padaczkowe i niedokrwistość megaloblastyczna. Wrodzone błędy syntezy kobalamin-kofaktorów stanowią niejednorodną i ważną grupę rzadkich zaburzeń. Continue reading „Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD ad”

Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD

Witamina B12 (kobalamina) jest niezbędnym kofaktorem w wielu szlakach metabolicznych. Wewnątrzkomórkowa konwersja kobalaminy do jej dwóch koenzymów, adenozylokobalaminy w mitochondriach i metylokobalamina w cytoplazmie jest konieczna do homeostazy kwasu metylomalonowego i homocysteiny. Dziewięć wad wewnątrzkomórkowego metabolizmu kobalaminy zostało zdefiniowanych za pomocą somatycznej analizy komplementacji. Jedna z tych wad, defekt cblD, może powodować wyizolowaną kwasowość metylomalonową, wyizolowaną homocystynurię lub oba. Osoby dotknięte obecnością mają wielotorowe nieprawidłowości kliniczne, w tym zmiany rozwojowe, hematologiczne, neurologiczne i metaboliczne. Continue reading „Identyfikacja genów dla metabolizmu witaminy B12 cblD”

Leczenie neoplazji nabłonka żylaków za pomocą miejscowego imikwimodu ad 7

Aby uniknąć jakichkolwiek uprzedzeń spowodowanych działaniami niepożądanymi badanego leku, dwóch niezależnych obserwatorów wykorzystujących zdjęcia uzyskane przed i po leczeniu oceniało zmniejszenie rozmiaru zmiany. Nie stwierdzono istotnych różnic między wynikami dwóch obserwatorów. Histologiczne dowody regresji oceniano niezależnie przez dwóch patologów i osiągnięto konsensus, gdy nie zgadzali się, czy zmiany powinny być klasyfikowane jako stopień 2 czy stopień 3. Trudności w ocenie śródnabłonkowej neoplazji sromu25,26 doprowadziły do nowej klasyfikacji, w której klasy 2 i 3 są połączone jako śródnabłonkowa neoplazja sromu (typ zwykły lub zróżnicowany). 27 śródnabłonkowa neoplazja sromu stopnia jako jednostka została porzucona, ponieważ minimalne zmiany związane z tym stopniem są zwykle wynikiem przejściowej infekcji HPV. Continue reading „Leczenie neoplazji nabłonka żylaków za pomocą miejscowego imikwimodu ad 7”

Leczenie neoplazji nabłonka żylaków za pomocą miejscowego imikwimodu ad 6

Wzrost był istotny tylko dla pacjentów, u których zmiany cofnęły się o ponad 75%. W skórze właściwej pacjentów leczonych imikwimodem, których zmiany uległy regresji o ponad 75%, zmniejszono liczbę komórek dendrytycznych CD207 +, komórek CD44 + dendrytycznych i komórek T regulatorowych; zmniejszenie było znaczące w przypadku komórek dendrytycznych CD207 + i limfocytów T regulatorowych (szczegóły w Dodatku Uzupełniającym). Objawy samooceny i jakość życia
W porównaniu z placebo, leczenie imichimodem zmniejszało świąd i ból w 20 tygodniu (odpowiednio P = 0,008 i P = 0,004) i 12 miesięcy (odpowiednio P = 0,04 i 0,02), zgodnie z analizą kowariancji z korektą dla wartości wyjściowych. W analizie powtarzanych pomiarów nie zaobserwowano istotnych różnic wyjściowych, po 20 tygodniach lub po 12 miesiącach między grupą imikwimodu a grupą placebo w zgłaszanej przez samych ludzi jakości życia, wizerunku ciała lub seksualności.
Kontynuacja
Wszystkich poza trzema pacjentami obserwowano przez 12 miesięcy (Tabela 3). Continue reading „Leczenie neoplazji nabłonka żylaków za pomocą miejscowego imikwimodu ad 6”